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设计上游引物,设计上游引物和下游引物

作者：admin 发布时间：2024-04-15 21:45 分类：资讯浏览：22

导读：为什么上游引物接近5,下游引物接近3上游引物：DNA分子两端不一样，因为核苷酸分子不是对称的，5位有个磷酸，3位是-OH就是：磷酸端和羟基端。DNA复制总是从5’端到3’端，因为...

为什么上游引物接近5,下游引物接近3

上游引物：DNA分子两端不一样，因为核苷酸分子不是对称的，5位有个磷酸，3位是-OH就是：磷酸端和羟基端。DNA复制总是从5’端到3’端，因为DNA聚合酶只能往3’端加核苷酸。

位置：上游引物位于DNA链的上游，与DNA模板链的5端相匹配。而下游引物位于DNA链的下游，与DNA模板链的3端相匹配。作用：上游引物的作用是与DNA模板链的5端结合，引导DNA聚合酶从5到3方向合成DNA链。

在PCR反应中，引物的方向性通常被表示为从3到5或者从5到3，其中3和5指的是引物末端上的碳原子编号。事实上，引物的方向性是影响PCR反应扩增效率的重要因素，因为PCR反应的扩增方向必须与模板DNA的方向相一致。

设计上游引物,设计上游引物和下游引物

1、复制序列，将之粘贴至在线软件“Primer3”或“Primer5”上，设定参数，设计引物并存档。在给出的引物序列中选取一对，用在线软件“NCBIBLAST”检索。

2、Complementarity - Second primer From Input ，即可查看引物能否形成发卡结构。6。满足条件的即可确定为比较好的qPCR引物，发送至公司邮箱合成即可。这只是设计qPCR引物的其中一种方法，大家可以选择自己熟悉的方法进行设计。

3、下载的0版注册一下就能用了，应该有中文说明设计引物的方法，看说明学习一下就可以了。

1、打开Sequence后，会弹出粘贴框，只需要将刚刚复制的基因序列粘贴上即可，然后点击下方的Add。

2、引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应（即错配）。

3、首先打开NCBI，选择“Nucleotide”，并在搜索框输入基因名。一般用目标基因的突变体1去设计引物，也就是要选择目标基因的“transcriptvariant1，mRNA”，没有1就用3，以此类推。

4、网址引物设计和验证的推荐网站为：Primer-Blast。这是一个专门设计用于在已知序列上设计引物或探针的工具。

5、引物5’端可以修饰。引物5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。验证引物的特异性：在“Primer Pair Specificity Checking Parameters”区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。

引物是一小段核苷酸。PCR中，两个引物分别与目地DNA的2条子链的两端互补，也就是如果从图的平面来看：一个引物与上一条链的左端互补，另一个引物与下一条子链的右端互补。所以两个引物的序列是不相同的，这样才不会乱。

PCR（聚合酶链式反应）需要两种引物，一种称为正向引物（Forward primer），另一种称为反向引物（Reverse primer），原因如下：定向放大：PCR的目的是在DNA模板上选择性地扩增特定的目标序列。

所以就先用不加酶切序列的引物扩增一轮，连TA载体，测序，然后用加酶切位点序列引物，进行第二轮扩增，更容易扩增。

DNA复制总是从5’端到3’端，因为DNA聚合酶只能往3’端加核苷酸。所以谁先复制谁上游，往后的就是下游，上游下游是个相对概念，是某一个序列／碱基相对于另一个序列／碱基而言。引物的概念我就不说了，看摆渡百科。

设计好引物后，分别在上下游引物的5’端加上你所需要引入的酶切位点就可以了。如果PCR产物需要酶切，就需要加上保护碱基。不同酶切位点所需要的保护碱基是不一样的，一般参考NEB网站上的一个保护碱基表。一搜就有了。

端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是g和c。⑦引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

1、PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。引物设计有3条基本原则：引物与模板的序列要紧密互补。

2、引物是一小段核苷酸。PCR中，两个引物分别与目地DNA的2条子链的两端互补，也就是如果从图的平面来看：一个引物与上一条链的左端互补，另一个引物与下一条子链的右端互补。

3、上游链就是结合在模板链3’端，也就是在正方向的上游，其延伸方向和正方向相同；而下游链结合在编码链5’端，也就是正方向的下游，其延伸方向和正方向相反了。

4、引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。

5、也可以设计成兼并引物。如果已经获得序列，只是需要设计引物将其中某段扩增出来，相对就简单些了，可以直接用上述软件进行设计就可以了。当然，实际操作起来还要看运气啦。